中华人民共和国进出口商品检验行业标准中华人民共和国进出口商品检验行业标准

　　　出口禽肉中莫能菌素残留量检验方法
　　　　　　　　　生物自显影法 SN 0296一93
Method for the determination of monensin
residues in poultry meat for export
?Bioautography method
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1 主题内容与适用范围
　　本标准规定了出口禽肉中莫能菌素残留量的抽样、制样和生物自显影测定法。
　　本标准适用于出口冻鸡中莫能菌素残留量的检验。
2　抽样和制样
2.1　检验批
　　以不超过2500件商品为一检验批。
　　同一检验批的商品应具有相同特征,如包装、标记、产地、规格和等级等。
2.2　抽样数量
　　　　　批量,件　　　　　　　　　　　　zui低抽样数,件
　　　　　　　　1～25　　　　　　　　　　　　　　　　1
　　　　　　　26～100　　　　　　　　　　　　　　　　5
　　　　　　　101～250 10
　　　　　　　251～500 15
　　　　　　　501～1000　　　　　　　　　　　　　　　17
　　　　　　1001～2500　　　　　　　　　　　　　　　20
2.3　抽样方法
　　按2.2规定的抽样件数随机抽取,逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品,原始样
品总量不少于2kg,放入清洁容器内,加封后标明标记,及时送交实验室。
2.4　样品制备
　　从每袋原始样品中取出部分有代表性样品,将可食部分放入高速组织捣碎机中捣碎均
匀,充分混匀,用四分法缩分出不少于1kg试样。装入清洁容器内,加封后标明标记。
2.5　样品保存
　　将试样于?18℃冷冻保存。
　　注：在抽样及制样过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
3　测定方法
3.1　方法提要
　　用甲醇提取肉样中莫能菌素,经四氯化碳萃取后浓缩至干,以甲醇溶解残留物,用薄
层分离,再用生物自显影法测定。
3.2　设备和材料
3.2.1　微量注射器：50 μL。
3.2.2　薄层板：硅胶,Q/YT 257?85SG,5cm×20cm,使用前110℃活化2h。
3.2.3　展开缸：240mm×57mm×32mm。
3.2.4　游标卡尺：测量范围0～200mm,精度0.02mm或使用抑菌圈测量仪测量。
3.2.5　离心机：转速3000 r/min。
3.2.6　旋转浓缩器。
3.2.7　恒温培养箱：37±1℃。
3.2.8　高压灭菌器。
3.2.9　长方形培养皿：20cm×10cm×5cm。
3.2.10 均质器：带均质杯250mL。
3.3　试剂和培养基
3.3.1　试剂
3.3.1.1　甲醇：分析纯。
3.3.1.2　四氯化碳：分析纯。
3.3.1.3 乙酸乙酯: 分析纯。
3.3.1.4　莫能菌素标准品: 960μg(效价)/mg(中国兽药监察所提供)。
3.3.1.5　试验菌种：枯草杆菌(Bacillus subtilis), 菌种号ATCC 6633(卫生部药品生物
制品检定所提供)。
3.3.2　培养基
3.3.2.1　菌种用培养基(见附录A 第A1章)。
3.3.2.2　生物自显影用培养基(见附录A第A2章)。
3.3.2.3　肉汤培养基(见附录A第A3章)。
3.4　测定步骤
3.4.1 工作液制备
3.4.1.1　莫能菌素标准贮备液
　　准确称取适量的莫能菌素标准品,用甲醇溶解配制成浓度为500μg(效价)/mL的莫能
菌素标准溶液。配制后于冰箱中保存,一周内使用。
3.4.1.2　莫能菌素标准工作液
　　吸取标准贮备液,用甲醇分别稀释成2,3,4,5,10和15μg(效价)/mL的标准工作
标准液。以上稀释液均须当日配制。
3.4.1.3　菌种培养及芽胞菌悬浮液制备
　　将菌种安瓿瓶的上部消毒后敲碎,加入少量肉汤培养基,使其溶解并移至肉汤管中混
匀。置37±1℃温箱中培养24h。将培养物接种于菌种培养基中,置于37±1℃培养一周,
镜检含芽胞菌数达85%以上, 便可制备芽胞悬浮液。
　　用适量灭菌生理盐水冲洗菌苔,然后将该菌液转移至离心管中,充分摇匀后,于3000
r /min离心30min, 弃去上清液,再加入同样量的灭菌生理盐水重复离心一次。弃去上清
液,再加入适量灭菌生理盐水,摇匀后于65℃水浴中加热30min,然后,于1000 r/min离
心5min, 取上清液并转入灭菌试管中,即为芽胞菌悬浮液,置于冰箱中保存,可使用一个
月。
3.4.2　试液制备：准确称取绞碎试样10g(至0.1g)于均质杯中,加入20mL甲醇,均质
2min后,移入离心管中,于3000 r/min离心20min。取其上清液15mL,转入盛有5mL蒸馏水
的250mL分液漏斗中,混合后加入10 mL四氯化碳,充分振摇,静置分层,放出四氯化碳层
于150 mL茄形瓶中。用四氯化碳再重复提取两次, 合并四氯化碳至上述茄形瓶中, 于50～
60℃水浴中用旋转蒸发器浓缩至干,加入0.5mL甲醇溶解残留物供TLC实验用。此样液中相
当于禽肉试样浓度为15g/mL。
3.4.3　测定
3.4.3.1 生物自显影
　　将每个样品及标准溶液分别点在四块薄层板上,先于每块薄层板下端2cm处划一条基
线,然后在这条基线上分别点20μL试液和3μg(效价)/mL莫能菌素标准溶液,试液和标准
溶液点相距2.5cm。在展开缸中用乙酸乙酯进行展开,直至溶剂前沿线距板顶端1.5cm处为
止,取出薄层板,风干后备培养用。
　　将薄层板水平置于高压灭菌的长方形培养皿中,无菌操作将已熔化并冷却至50～55℃
的生物自显影用培养基均匀地喷在其表面上,然后用10mL上述接种芽胞菌悬液的培养基铺
满整个薄层板,保持水平,待其凝固,于37±1℃培养18 h。
3.4.3.2　对照试验
　　除不加试样外,按上述测定步骤进行。
3.5　结果计算和表述
　　经过培养后,在薄层板上与莫能菌素标准液产生抑菌圈的Rf值(约0.38)相同位置上,
显现抑菌圈者即为阳性。
　　当样品判定为阳性时,测量四块薄层板上的试液及标准溶液产生的抑菌圈直径,分别
计算出平均值。当每组四个直径值的相对标准偏差(RSD)均不超过5%时,并且试液的抑菌
圈直径与标准溶液(20μL)的抑菌圈直径近似(直径相差不超过±1mm),则其样品中莫能菌
素含量按下式计算：
c
X＝──
m
式中：X??样品中莫能菌素的含量,mg/kg；
　　　c??试验中所用的标准溶液的浓度,μg/mL；
　　　m??zui终试液所代表的禽肉试样的浓度,g/mL。
4　测定低限、回收率
4.1　测定低限
　　本方法测定低限为0.20mg(效价)/kg。
4.2　回收率
　　回收率的实验数据:莫能菌素浓度在0.20～0.67mg(效价)/kg范围内,回收率为81%～
100%。

附　录 A　
　　　　　　　　　　　　　培养基成分及制备方法
　　　　　　　　　　　　　　　　 (补充件)
A1　菌种用培养基
　　　　　蛋白胨 10.0g
　　　　　牛肉浸膏 5.0g
　　　　　氯化钠　　　　　　　　　 2.5g
　　　　　琼脂 15.0g
　　　　　蒸馏水 1000mL
　　将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其
灭菌后pH为6.5±0.1,分装于试管或克氏瓶内,于121℃ 15min高压灭菌,灭菌后制备成
所需斜面备用。
A2　生物自显影用培养基
　　　　　蛋白胨 10.0g
　　　　　酵母浸膏　　　　　　　　 2.5g
　　　　　葡萄糖 10.0g
　　　　　琼脂 15.0g
　　　　　蒸馏水 1000mL
　　将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其
灭菌后pH为6.0±0.1,分装于锥形瓶内,于121℃15 min高压灭菌,备用。
A3　肉汤培养基
　　　　　蛋白胨 10.0g
　　　　　牛肉浸膏　　　　　　　　 5.0g
　　　　　氯化钠　　　　　　　　　 2.5g
　　　　　蒸馏水 1000mL
　　将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使
其灭菌后pH为7.0±0.1,分装于试管中,于121℃15min高压灭菌。

附录 B　
　　　　　　　　　　　　　　　　检验程序图
　　　　　　　　　　　　　　　　 (补充件)
试样(10.0g) 试验菌培养
┃┃
┃于均质杯内加入┃
┃ 20 mL甲醇┃
┃┃
均质2 min ┃
┃移入离心管┃
┃┃
离心20 min(3000r/min) 菌液制备
┃┃
取上清液(15 mL) ┃
┃转入盛有5mL蒸馏生物自显影用培养基
┃水的分液漏斗中┃
┃┃
┃┃
加入四氯化碳(10 mL) ┃
┃充分振摇后分取四氯化碳层┃
┃转入茄形瓶中, 再重复两次┃
┃┃
合并入上述茄形瓶中┃
┃┃
　　蒸干┃
┃┃
用0.5mL甲醇溶解┃
┃┃
层析┃
┃┃
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┃
培养
┃
┃
检定
┃
┃
结果和表述

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附加说明:
　　本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
　　本标准由中华人民共和国天津进出口商品检验局负责起草。
　　本标准主要起草人袁而森、王素琴、李剑影。
　　本标准等同采用日本厚生省检验方法：畜水产食品中の残留物质检查法(1990)。
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中华人民共和国国家进出口商品检验局1993-12-28批准 1994-05-01实施